ELISA夾心法實驗步驟和注意事項

以下是本生ELISA夾心法實驗的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程及關(guān)鍵注意事項：

一、實驗步驟詳解

抗體包被‌

用pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋捕獲抗體至1-10μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被過夜或37℃孵育2小時

棄液后使用含0.1%吐溫的PBS洗板3次，每次浸泡3分鐘并拍干

封閉非特異性位點‌

加入200μl/孔封閉液(3% BSA或5%脫脂牛奶)，37℃孵育1小時

重復(fù)洗滌步驟，確保去除未結(jié)合封閉劑

樣本孵育‌

加入100μl待測樣本/標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育1小時，同時設(shè)置空白孔與對照孔

標(biāo)準(zhǔn)品需梯度稀釋(建議2倍系列稀釋)，樣本濃度過高時需預(yù)稀釋

酶標(biāo)抗體結(jié)合‌

洗滌后加入100μl HRP標(biāo)記檢測抗體，37℃孵育1小時

嚴(yán)格洗板5次以去除游離抗體(關(guān)鍵步驟)

顯色與終止‌

每孔加入90-100μl TMB底物，37℃避光顯色15分鐘(觀察標(biāo)準(zhǔn)孔梯度)

加入50μl 2M硫酸終止反應(yīng)，顏色由藍變黃

結(jié)果讀取‌

終止后10分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測定450nm吸光度(參考波長630nm)

　　二、關(guān)鍵注意事項

樣本處理‌

血清樣本需6小時內(nèi)分離，避免溶血(血紅蛋白干擾顯色)

凍存樣本避免反復(fù)凍融，檢測前需離心去除沉淀

試劑控制‌

所有試劑使用前平衡至室溫(約30分鐘)，但酶標(biāo)抗體需避光

不同批號試劑禁止混用，濃縮洗滌液結(jié)晶需37℃溶解

操作規(guī)范‌

加樣時槍頭勿觸碰孔壁，避免氣泡產(chǎn)生

洗板后需拍干(吸水紙需及時更換)，但避免過度干燥

質(zhì)量控制‌

陽性對照OD值應(yīng)≥0.8，陰性對照OD值≤0.2(否則實驗無效)

建議樣本做復(fù)孔檢測，CV值應(yīng)控制在15%以內(nèi)

三、異常處理建議

高本底值‌：增加封閉液濃度(5% BSA)或延長封閉時間至2小時

顯色異常‌：檢查酶標(biāo)抗體活性及底物是否失效，顯色時間不超過30分鐘

附：實驗流程時序圖

A[包被抗體] --> B[封閉]

B --> C[加樣本]

C --> D[酶標(biāo)抗體]

D --> E[顯色]

E --> F[終止測定]

通過規(guī)范操作和嚴(yán)格質(zhì)控，可確保檢測靈敏度達到pg級別。

注：以上資料僅供參考，如需具體品牌產(chǎn)品的完整說明，建議提供貨號或廠商名稱以便進一步確認(rèn)。

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